ABI7500热盖 本公司可以少量提供ABI7500PCR仪 全新或培修热盖部件(Cover)超长保修,可布置工程师全国**装置及调试。
ABI7500热盖简介:本公司可以少量提供ABI7500/7300这PCR仪全新或培修热盖部件(Cover)超长保修,可布置工程师全国**装置及调试,*。现货供应ABI 7500、ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪,,美国出口创新仪器,一年保修期。少量现货高价供应各种出口品牌的荧光定量PCR仪。ABI7500热盖运行:一. 开 机1. 确认电脑与服务器的数据通信线(灰色USB连线)衔接正确。2. 确认电脑处于外接电源供电形态。3. 启动电脑,以Administrator用户名登录,进入Windows2000操作系统。4. 待桌面图标产生后,关上7000服务器的电源。5. 待服务器的电源批示灯点亮后,启动7000 SDS运行软件。在启动实验之前,请先审核样品加热模块以确定它没有遭到荧光污染,详细方法请依照第6节的“荧光污染的审核与解决”流程启动。二. 实时定量的软件运转基因表白的定量和相对定量钻研、转基因食品的检测(GMO)、各种病原体的测验检疫等各种定量运行;以CT值的大小作为样品阴性、阳性判定依据的定性运行;以及SNP检测、等位基因鉴定实验等的步PCR扩增,都是驳回实时定量形式,依照以下步骤操作。1. 新建文件 菜单File → New,Assay选用Absolute Quantification (实时定量形式),关上一个空白的96孔板文件。
2. 探针设置 双击恣意一个孔,关上Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector关上。3. 经常使用软件,或许探针(Detector)没有设置好,请点击Add Detector按钮,关上Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager关上。假设Detector列表中没有适合的探针,点击按钮File → New,新建探针:设定探针的称号(倡导经常使用所钻研基因符号,如GAPDH、ACTIN等)、报告基团(FAM或许VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA;MGB探针选None)、色彩等。设置实现后点击OK,该探针即出如今探针列表中。重复此环节,设立其余的探针。4. 在Detector Manager窗口,从探针列表中点击选用所需探针,按住Ctrl键可以选用多个探针,再点击Add to Plate Document按钮。zui后点击Done封锁Detector Manager窗口。此时Well Inspector窗口依然是关上的。5. 填样品表 在96孔表当选定有样品的一个或多个孔,在Well Inspector页面的Sample Name栏中填入样品称号;在探针列表的Use项下的方框中,打钩选用要用的一个或多个探针;在Task栏当选用样品类领:阴性对照选NTC;未知样品选Unknown;规范品选Standard。关于Standard,还要在Quantity栏中输入DNA拷贝数。注 意:只要在这里输入拷贝数后,软件能力智能生成规范曲线。倡导规范品的浓度在5点以上。倡导每个样品(包含规范品)都依照统计学要求作必定数量的复管。6. 参比荧光 假设经常使用的是ABI公司的定量PCR试剂,如TaqMan Universal PCR Master Mix或许SYBR Green PCR Master Mix等,参比荧光(Passive Reference)选ROX;假设经常使用的试剂中不含有参比荧光,请选None。实现后点击右上角的X按钮,封锁Well Inspector窗口。7. 循环参数 切换到Instrument页面,设定及修正PCR热循环:在ABI公司自动的中,50 C°C 2 C 15°min是UNG酶起作用的步骤,UNG酶可以预防其余PCR扩增的产物(其中以U替代T)对定量PCR的污染;95 C 1°10 min是定量PCR的循环步骤。7000自动在zui后一步,也就是60°min的作用是激活金牌Taq酶,同时灭活UNG酶;40个循环的95 C 1°sec和60 min复性和加长时搜集荧光信号。假设经常使用ABI公司的定量PCR试剂,上述参数不须要调整,间接运转PCR循环就可以了。在经常使用其余厂家试剂的状况下,假设其中没有UNG酶,请删除50°C 2 min步骤;假设经常使用的不是金牌Taq酶而是其余普通的Taq酶,请删除95°C 10 min步骤。8. 循环参数的修正方法 删除:按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击,该步骤被选中变黑,按Del键即可删该步骤或循环。拔出:在须要拔出参数的位置点击,产生粗黑竖线后,区分点击Add Hold、Add Cycle或Add Step按钮参与保温、循环或循环中的一个步骤。修正温度和期间:拖动鼠标,选中须要修正的温度或期间数字,输入新的数值即可。9. 其余设置 反响体积:定量PCR的规范反响体积是50 μL;假构想修正的话,倡导大于25 μL。融解曲线实验:在Dissociation Protocol选项左边的方框中打钩,仪器即在定量PCR循环实现后继续做融解曲线实验。假设是驳回SYBR Green I染料方法启动定量钻研,倡导启动融解曲线实验,以判定PCR反响特异与否。单峰示意繁多的PCR扩增产物,多峰示意PCR扩增有杂带。注 意:只要SYBR Green I染料方法才须要启动融解曲线实验,TaqMan探针和MGB探针法都不须要。9600 Emulation:选中此项,即可使7000的升降温速度减慢,与9600和7700一样,从而可以间接经常使用在9600、7700型PCR仪上提升好的循环条件,而不需任何修正。10. 启动扩增 点Save按钮保留文件设置。确认96孔板或所有样品管在服务器内搁置得当后,点击Start按钮,开局PCR循环。屏幕上灵活显示PCR进程和残余期间。11. 监控进程 切换到Results页面的Amp Plot子页面,可以实时显示PCR曲线随着循环参与而逐渐增长的实践状况。假设Detector选FAM或VIC,只显示对应探针的变动状况;假设选All,则同时显示一切探针的反响进程。12. 保留结果 完结后,点Disconnect按钮,而后File → Save保留实验结果。可以保留为.sds格局,也可以保留为.sdt格局,作为以后同类实验的模板,节俭软件设置期间。三. 实时定量的数据剖析1. 数据剖析 切换到Result页面,进入扩增曲线(Amplification Plot)子页面,检查软件曾经智能剖析好的实验结果。注 意:此时的数据是软件依据自动值(基线终点为3,终点为15)获取的初步结果,还须要依据本次实验的详细状况,精细调理Baseline(基线)的起止点后,从新剖析,以获取更准确的数据。2. 基线的终点和终点确定准则 基线(Baseline)是指PCR开局时信号很低、接近背景且比拟颠簸的那个阶段。终点要避开开局几个循环由于高温造成的信号增高,设在信号曾经降到背景高度且能维持颠簸的中央,普通在3到6个循环之间;终点要防止笼罩信号曾经开局有显著增长的中央,普通在本组数据中zui小的CT值前再3个循环处。另外,终点与终点之间zui好能距离8个循环以上,以满足统计基线规范偏向的数学要求。调整好起止点以后,再点击Analyze按钮,软件即智能计算新的阈值和CT值,并降级实验报告。注 意:此时扩增曲线页面上显示的阈值数字并不降级,然而这不影响后盾数据运算的准确。3. 线性图谱 在自动的设置中,PCR扩增曲线图谱的纵坐标代表经过ROX和空白校对后的相对荧光信号强度,横坐标代表PCR循环次数(从1到40);纵坐标以对数示意,横坐标以线性示意。假设要看*线性的S形图谱,请双击纵坐标轴线,关上坐标设置窗口,将纵坐标改成线性方式。4. 原始数据 切换到Component子页面,观察原始数据。反常的FAM信号强度,基线时约为5000点,扩增实现到达约28000点,两边呈S形增长;TAMRA和ROX的信号开局时都比FAM的基线要稍低一点,TAMRA信号到指数增长阶段会降落,而ROX信号是水安稳固的,不随PCR进程而扭转,由于ROX是以固定浓度参与到PCR试剂中的,它自身并不介入PCR扩增。5. 原始数据 切换到Spectra子页面,也可以观察原始数据。Spectra与Component这两个页面的区别是:Component显示的是信号强度随期间(即PCR循环次数)的变动,是纵向的;而Spectra显示的是每个PCR循环点上信号强度在不同波长上的散布,也就是在4个滤色片上的散布,是横向的。6. 规范曲线 切换到Standard Curve子页面,观察规范曲线。注 意:只要在Set up时输入规范品的拷贝数后,软件能力智能生成规范曲线。7. 实验报告 切换到Report子页面,观察实验报告。确认无误后,保留结果。也可以从File菜单当选用Export,再选用数据类型,输入各种类型的数据,包含CT值、相对信号强度、原始数据、融解曲线数据和实验结果等。输入的数据可以用Excel关上,并可在Excel中重重生成扩增曲线、规范曲线等图谱。四. 终点读板的软件运转各种等位基因鉴定实验,包含SNP检测、基因突变检测等,都包含两个阶段:1、PCR扩增;2、扩增后的荧光信号读取(Post-read)和数据解决。步既可以在9700、9600等普通的PCR仪上启动,也可以在7000、7900等定量PCR仪上启动;第二步必定在定量PCR仪上启动。以下只叙说第二步Post-Read和数据解决的操作方法。假设步也在定量PCR仪上启动,请按第三节实时定量的实验方法设置和运转软件;待PCR实现、数据保留好后,再将同一块板放在7000上,按以下步骤操作。1. 新建文件 菜单File → New,Assay选用Allelic Discrimination (终点读板形式,用于SNP剖析等),新建一个空白96孔板文件。2. 探针设置 双击恣意一个孔,关上Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector关上。3. 经常使用软件,或许Marker没有设置好,先点击Add Detector按钮,关上Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager关上。假设Detector列表中没有适合的探针,File → New,新建探针,设定探针的称号(倡导经常使用等位基因的称号,如Allele 1、Allele 2等)、报告基团(FAM或许VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA;MGB探针选None)、色彩(恣意)等。设置实现后点击OK,该探针即出如今探针列表中。4. 位点设置 Detector设置好后,点击Add Marker按钮,关上Marker Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Marker Manager关上。假设在Marker列表中找不到适合的探针,点Create Marker,取名(倡导经常使用位点的称号,如D2S1356等),OK,新位点的名字即出如今左边的位点列表中,选中位点,在左边的探针列表中打钩选用与该位点配套的探针,普通FAM、VIC各一个组成一套。5. 选用位点 Marker设置实现后,在左边的位点列表当选中该Marker,点击Copy to Plate Document按钮,该Marker的消息即分红3行出如今Well Inspector窗口中。重复选好所有所需Marker,再点击Done封锁Marker Manager窗口。注 意:定量PCR实验只需求设置探针(Detector)即可,而SNP实验既要设置探针(Detector),还要设置位点(Marker)。假设没有设置Marker,软件将不能启动基因分型。6. 填样品表 在96孔表当选定有同类样品的一个或多个孔,在Well Inspector页面的Marker列表的Use项下的方框中打钩,选用要用的Marker,而后在探针的Task栏选用样品类型:阴性对照选NTC;未知样品选Unknown。没有Std。7. 参比荧光 假设用的是ABI公司的PCR试剂,如TaqMan Universal PCR Master Mix with or without UNG,参比荧光(Passive Reference)选ROX;假设所用试剂中不含ROX参比荧光,请选None。点击右上角的X按钮封锁Well Inspector窗口。8. 循环参数 切换到Instrument页面。PCR热循环只要60°C一个步骤,不须要修正。设置反响体积。SNP的规范反响体积是50 μL。点Save按钮保留文件设置。9. 终点读板 确认96孔板或所有样品管在服务器内搁置得当后,点击Post-read按钮,开局读取数据,大概10秒实现。10. 保留结果 完结后点Disconnect按钮,而后File → Save保留实验结果。五. 终点读板的数据剖析1. 数据剖析 切换到Results页面,Allelic discrimination子页面,在Marker下拉菜单当选用要检查其数据的Marker,在上方96孔板界面中按Excel方式选用须要检查的样品孔,软件即在两边的图谱上显示信号的散布状况。选用不同的Marker,显示不同的信号。可以点击加大或增加工具调整图谱的大小。2. 信号散布 反常的信号应该分为4组,接近原点处为NTC;接近X轴的是VIC信号,是纯合子,其反常信号强度范畴在2-8之间;接近Y轴的是FAM信号,是另一种纯合子,其反常信号强度范畴在4-16之间;接近对角线位置的样品中既有FAM信号也有VIC信号,是杂合子,强度为FAM和VIC各自的一半左右。3. 基因分型 点击套索工具,而后经过鼠标圈定NTC信号,在Call下拉菜单当选NTC,这些数据点即被分型为NTC并显示相应的色彩和图标;雷同分型FAM纯合子、VIC纯合子和杂合子。4. 保留结果 切换到Report页面看实验报告。确认无误后,保留剖析结果。也可以从File菜单当选用Export,再选用数据类型,输入各种类型的数据。六. 日常保养1. 荧光污染的审核与解决 新建一个空的96孔板,菜单Instrument → Calibrate关上ROI Inspector窗口,将Exposure Time调到4096,选定Filter B,点击Snapshot按钮(不要动上方两个按钮,免得ROI设置出错),此时可以看到陈列划一的96孔图像。假设观察到特意明亮的光斑,则标明该孔存在荧光污染。将光标移动到单个孔的上方可在右侧栏中的Pixel Intensity处读出该孔的荧光信号值,超越500以上的须要荡涤。荡涤时尽量经常使用较细且无硬物突出的干棉签擦拭;假设未能去除,可用去离子水荡涤;如污垢固执,可经常使用90%乙醇荡涤,但要等乙醇*挥发洁净前方可盖上热盖,免得无机溶剂挫伤热盖上的透镜组。2. 检测器光源的改换流程 关机冷却约15分钟后,关上仪器顶部盖板,拧松灯泡包全罩的螺钉,取下包全罩,将灯泡拆下,改换新的灯泡并插好连线。注 意:备用的新灯泡必定保留在枯燥环境中。